现代免疫学测定技术源于标记技术的发展。继1941年Coons等创立荧光素标记抗体技术(f1uorescent antibody technique)以来，上个世纪50年代末60年代初,Yalow等创立了放射免疫分析(radioimmunoassay, RIA)技术，1966年由美国和法国学者又同时报道建立了酶免疫测定技术(enzyme immunoassay,EIA),包括:酶免疫组化技术,固相酶免疫测定(如ELISA,western blotting)和均相酶免疫测定(又称酶放大免疫分析技术,EMIT)。另一传统标记技术为胶体金标记免疫分析始于上个世纪80年代，除应用于免疫电镜外，广泛用于免疫渗滤和免疫层析试验[1]。除此之外,目前又相继报道建立了一些新型标记免疫测定技术,如元素标记免疫测定，核酸标记免疫测定和量子点标记免疫测定技术。这些技术及由此衍生的实验方法有些已在临床免疫学检验中得到了广泛的应用，有些尚处于研究和探索阶段。本文主要就相关技术的应用及进展综述如下。

　　1.荧光素标记的免疫测定技术

　　1.1 间接免疫荧光技术(IFA) 长期以来用作细胞内抗原定位或相应抗体检测的“金标准”,适合用作筛查实验,主要用于抗核抗体(ANA)、抗ds-DNA抗体、抗平滑肌抗体(ASMA)、抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)等自身抗体,及某些病原体如EB病毒、SARS病毒、军团菌及其他呼吸道病原体抗体的检测等[2,3]。目前已有商品化的全自动操作系统,可以自动完成对样品的稀释、加样、温育、洗涤等过程。最后借助于激光共聚焦显微镜或荧光显微镜观察结果。其技术特点是减少手工操作可能造成的偶然误差，提高了免疫试验的标准化和自动化程度，缩短了实验所需的时间。

　　1.2 流式细胞免疫荧光分析(FCM) 该技术借鉴了荧光抗体与血细胞分析仪原理, 经历了从相对细胞计数到绝对细胞计数, 从细胞膜成份到细胞内成份, 从单色荧光到多色荧光的发展历程, 并将分子表型与免疫表型分析相结合, 因而成为细胞分析和分选的重要工具[4]。其工作流程包括标本处理与荧光染色, 激光聚焦检测, 流动控制, 信号的处理与放大, 以及计算机分析和结果打印。在细胞表型 (celluar phenotype)分析、DNA含量与细胞周期分析、细胞内及核膜成分分析及细胞分选等领域有着广泛的应用。

　　1.3 以荧光标记为基础的四聚体分析技术 该技术主要是基于MHC/抗原肽复合物与T细胞表面受体(TCR)相互作用的原理而设计的。首先选择某一抗原特异性T细胞所识别的抗原表位肽以及与该表位肽结合的HLA分子，使之形成HLA-肽复合物，进一步生物素化后再与特定荧光素(如PE)标记的链霉亲合素按照一定比例混合，如此构建的四聚体即可通过其本身MHC分子提呈的表位肽与T细胞表面的TCR进行精确识别和高亲和力结合而达到检测抗原特异性T细胞的目的[5]。由其衍生的主要技术类型包括:(1)MHC-肽四聚体流式细胞术，特点是快速、敏感、特异，可计数所有抗原特异性T细胞,不管这些细胞是原始的或效应的,有功能的或无功能的;(2)原位MHC-肽四聚体染色法(IST)，又可分为直接法和间接法两种，用于组织切片染色，检测抗原特异性T细胞在空间和时间上的分布;(3) MHC-肽四聚体磁分离技术，分离的抗原特异性T细胞可用于进一步分析其生物学功能;(4)MHC-肽四聚体ELISA法;(5)MHC-肽四聚体分子微阵列技术。上述以荧光标记为基础的四聚体分析技术均已应用于病毒(如HBV、HCV和HIV等)抗原、肿瘤抗原特异性T细胞和自身免疫病相关的自身反应性T细胞(ART)的测定和研究中。

　　2. 酶标记免疫测定技术(EIA)

　　EIA目前仍为临床免疫学实验室最广泛应用的实验技术之一，由此衍生出的常用技术和新方法主要有如下几种。

　　2.1 酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA) 理论上只要能获得某一抗原纯品或相应的抗体制剂,即可对其相应的抗体或抗原进行ELISA测定。因此，几乎所有的可溶性抗原、抗体系统均可用该技术进行检测，其特点是实验结果具有较高的敏感性和特异性，最小可测值达ng甚至pg水平，但易受诸多测定因素(如包被抗原、抗体的质量，微孔板表面的吸附性能等)的干扰。与放射免疫分析相比，ELISA技术优点是标记试剂相对比较稳定，且无放射性危害。因而在血源病原体(抗原和抗体)，体液中各种微量蛋白(肿瘤标志物，细胞因子，小分子激素，自身抗体和某些毒品、药物等)方面均有着广泛的应用[1]。除手工操作外，目前已有自动化的酶免疫分析系统(有开放和封闭式两种类型)，可根据需要选择合适的或与仪器配套的试剂使用。

　　2.2 以酶标记为基础的免疫印迹和免疫斑点技术 免疫印迹(immunoblotting,IB)和免疫斑点(immunodot,ID)测定是两种密切相关而又有所不同的分析技术，前者是将组织、细胞或细菌裂解物的蛋白质成分通过SDS-PAGE分离开来，再转移至硝酸纤维素(NC)膜上进行分析，而后者则是直接将纯化或基因重组的蛋白质抗原以点状或线状的形式固相至NC膜表面，后续的与样品、酶结合抗体反应及呈色步骤则完全相同。由于实验中采用的是蛋白质亚单位或抗原分子纯品，因此，该技术可用于对单特异性抗原或抗体的确认，如用于HIV、HCV感染的确诊试验，以及抗核抗体中ENA多肽抗体谱(见图1)，特异性变应原(IgE作用的靶抗原)等项目的检查[3]。除定性检查外，实验中还可对其显色条带或斑点进行扫描，以报告其定量测定结果。

　　2.3 酶联免疫斑点技术(enzyme-linked immunospot，ELIspot) ELIspot是在ELISA方法的基础上发展起来的一种用于测定B细胞分泌免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)、T细胞分泌细胞因子(cytokine,CK)功能的分析技术，为定量ELISA技术的延伸和发展。其原理和实验设计是在微孔培养板底部包被特异性抗某种Ig或CK的单克隆抗体。待检测的外周血单个核细胞(PBMC)加入到微孔板内培养，在特异性抗原或有丝分裂原的作用下，数小时内记忆型B细胞或T细胞即活化并分泌Ig或CK，当即就被位于细胞下方的固相单克隆抗体所捕获。洗去细胞后，被捕获的Ig或细胞因子与随后加入的生物素化第二抗体结合，再加入酶标记的亲合素与生物素反应，以酶底物显色，阳性细胞即可在固相板底的局部形成直径约50～200μm大小不等的圆形斑点[6]。每一个斑点对应分泌Ig或CK的一个细胞，斑点直径的大小直接反映特定阳性B、T细胞族群的产能。

　　该技术除最初用于检测分泌抗体的B细胞外，更多的则是用于检测T细胞各类CK的分泌状况，因此，ELIspot已成为当今免疫学研究中T细胞功能测定的标准技术。其优点在于提供了一个接近于体内的实验环境，在几乎自然生理条件下，观察单个细胞分泌免疫活性物质的进程。能检出频率为百万分之一的阳性细胞，这种分辨率已经远远超过胞内细胞因子的四聚体染色和ELISA法测定的灵敏度[7]。由于该技术易受多种测定因素的干扰，因此对实验操作要求较高，包括抗体包被、洗涤、激活物(如特异性抗原肽)的加入、细胞接种及培养均需严格无菌;在细胞培养过程中应避免移动、碰撞，尽量减少开关培养箱的次数，否则会导致细胞移位，造成斑点模糊和拖尾现象的发生。同时应多设重复孔，并设置阳性、阴性和空白对照。为实现不同实验者或实验室检测结果的可比性，还需有一种定量的质控系统。目前，国际上多采用核心参比实验室的质控方法，即以核心参比实验室的质控细胞为质控品，对本实验室的结果进行质量控制。

　　3.以新型标记物为基础的免疫测定技术

　　3.1 元素标记免疫测定技术 主要有以镧系元素(如Eu3+,Tb3+或Sm3+等)作为标记物的时间分辨荧光免疫分析(TrFIA)和钌元素(Ru)作为标记物的电化学发光免疫分析(ECLIA)。TrFIA除有测定范围宽，试剂稳定，测定速度快，灵敏度和特异性高外，还可通过双标记进行两种指标的同时测定[8]。由Roche-Boehringer Mannheim开发的ECLIA技术，其特点是元素钌可以在电场作用下反复被激发而使信号得以放大，测定灵敏度较通常的化学发光免疫分析(ECLIA)要高得多[9]，这些元素标记免疫测定均需特定的仪器设备并用配套试剂。

　　3.2 核酸标记免疫测定技术 该技术是以核酸的扩增或转录翻译为基础的。DNA与上述标记物不同，其本身并无指示特性，但通过聚合酶链反应(PCR)，可在数小时内扩增数百万倍，因而具有极高的检测灵敏度[10]。而转录翻译则是将编码酶(如荧火虫荧光酶和β-半乳糖苷酶α肽)的DNA片段标记抗体，抗原抗体固相反应后再对DNA进行细胞外转录翻译成相应的酶进行测定[1]。由于1个DNA分子经转录可得到多个mRNA分子，同时1个RNA分子经翻译又可生成数个蛋白质分子，因此也具有很高的测定敏感性。但这类技术目前尚处于探索和研究阶段，也无现成的商品试剂盒供应。

　　2.3 量子点标记免疫测定技术 量子点(quantum dots, QD)又称半导体纳米微晶粒(semiconductor nanocrystal)，通常是由ⅡB 和ⅥA族元素组成，目前研究较多的主要是CdX(X=S、Se、Te)，粒径范围为2～20 nm。1998年美国加州伯克利大学的Alivisatos[11]和印地安纳大学的Nie等[12]所在的研究小组同时在Science上发表相应的研究成果，最早提出了量子点作为生物标记物的设想。因量子点为多电子体系，发光效力远高于单个分子，稳定性能亦高出荧光染料分子的100倍，且不同粒径量子点受同一束光激发可产生不同颜色的荧光。因此，QD具有良好的光电性能、尺寸效应和高通量应用的潜能，并将有可能取代传统染料成为新一代荧光标记物。最近，Goldman等[13]分别用不同颜色的量子点标记抗蓖麻毒素、霍乱毒素、志贺菌毒素1和葡萄球菌肠毒素B的抗体，在同一块微孔板上实现了对上述4种毒素的同时检测。尽管QD作为荧光标记物在免疫测定中的研究才刚刚起步，但结果已显示了在多种项目同时测定的优势。因此，该技术在诸如生物多组分同时测定、免疫示踪定位、细胞成像及疾病早期诊断中将有广泛的应用前景。

　　4.其他新型分析技术平台

　　4.1 微阵列免疫芯片技术：以微阵列为基础的免疫芯片技术是一种高通量、微型化和自动化的蛋白质分析方法，有别于一般的DNA芯片技术，其原理类似于ELISA的实验模式,主要是基于抗原与抗体特异性结合反应来设计的，所测目的分子仅有结构上的专一性，而无序列特异性[14]。该技术预先将基因重组蛋白或从组织细胞中分离纯化的抗原(如蛋白质、DNA或磷脂分子等)或单克隆抗体分子有序排列并固定在芯片表面制成微阵列，对背景封闭后即可与血清样本反应，捕获样品中对应的目的分子，再加入荧光素标记的第二抗体进行反应(若采用酶标记的二抗反应，则需用特异性底物/色原溶液呈色)。最后用CCD(charge-coupled device)照相技术与激光扫描系统获取阵列图像，利用专门的计算机软件进行图像处理和结果分析。该法突出的优点在于减少了被检样本和试剂的用量，可对血清样本中多种目的分子(包括自身抗体或其他微量蛋白)实施高通量的平行检测与分析。由我国自行开发研制的多肿瘤标志物蛋白芯片检测系统，采用固相单克隆抗体制作的微阵列可对12种不同的肿瘤标志物进行同时检测，其优点是可同时检测多种肿瘤标志物，提供相对全面和客观的临床信息，作为其他肿瘤诊断技术的补充[15]。用于病原体感染诊断的结核杆菌蛋白芯片则是将3种结核分枝杆菌(TB)特异性抗原(脂阿拉伯甘露糖(LAM)、分子量38000和16000的蛋白质)固定于微孔滤膜表面，利用其渗滤和浓缩作用，使抗原抗体反应在固相膜上快速进行，再以免疫金标记的抗人Ig作为二抗直接在膜上显色(紫红色斑点)。该法技术特点是可同时筛查多种TB抗原的抗体，方便、快速而又有较高的特异性和敏感性，特别是对痰涂片阴性及肺外结核病人的检出，更具有优越性[16]。用于自身抗体谱检测的芯片技术则是将各种自身抗体的靶抗原固相至载体表面(载玻片或滤膜)制成抗原分子微阵列[14,17]，可用于系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎(RA)等自身免疫性疾病的辅助诊断。

　　4.2 液态芯片技术(liquid Chip) 该技术是基于流式细胞计数原理而设计的一种均相微珠免疫分析系统，分别将抗原或单克隆抗体包被至特定的微珠表面(可被一束激光识别)，与样本中的抗体或抗原结合后，再与荧光素标记的第二抗体反应，由另一束激光激发测定其荧光强度值而达到定量的目的。其特点是可同时检测和定量一份样本中的多种指标，并具有极高的检测速度、测试敏感度和良好的结果特异性[18]。该技术还可根据实验目的的不同,进行测试项目的任意组合，是目前唯一得到美国FDA认证、并允许进入临床实验室应用的芯片技术。Rouquette等[19]用此技术检测了222例病人血清中9种抗核抗体(抗dsDNA、抗SSA、抗SSB、抗Sm、抗U1RNP、抗Scl-70、抗Jo-1、抗ribosome和抗centromere B抗体)，敏感性为99.1%，特异性为100%，CV值小于10%，各项指标与ELISA法测定值的相关系数均在0.90～0.97之间。除此之外，该技术还可用于对各种细胞因子、小分子激素、肿瘤标志物，以及传染病和神经-内分泌系统疾病等的诸多指标进行检测。因此，任何使用微量分析系统的测试项目都有可能利用该技术得到更好的发展[18,20]。

　　4.3 表面增强激光离子化解吸-飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS) SELDI-TOF-MS是继DNA指纹图谱后发展建立的又一指纹图谱分析技术(即蛋白表型指纹分析)。通过不同固相模式将探针分子吸附于芯片表面，在捕获样品中的目的蛋白后，通过加入能量吸收分子和接受激光束的轰击，即可使吸附在阵列芯片表面的靶蛋白离子化，在电场力作用下飞行，通过检测离子的飞行时间计算出其质量电荷比，用以分析蛋白质的分子量和相对含量[21]。美国Ciphergen Biosystems 公司利用这一技术检测了来自健康人和前列腺癌患者的血清样品,在3天时间内发现了6种潜在的前列腺癌生物学标志，显示了此技术用于疾病表型指纹分析的技术优势[14,22]。但由于该技术还存在一定程度的方法学稳定性和重复性问题，目前尚处于研究和探索阶段。

　　5.临床免疫测定技术的发展趋势

　　经典的免疫学测定技术(如凝集试验、沉淀反应、琼脂扩散和免疫电泳等)由于仅能定性或简单定量，灵敏度低，耗时费力，不能自动化。因此，逐渐被高敏感度和高特异性的现代免疫学测定方法所取代，而这些又主要是源于抗原抗体特异性结合及各种不同标记物使用的结果。特别是随着分子生物学、微纳电子学和分子组装技术等方面取得的进展，使得临床免疫测定技术正朝着一个全新的方向发展。在实验采用的抗原体系中，以往由组织、细胞裂解物提取的抗原逐渐向基因工程抗原转变，并由单一病原体蛋白向多决定簇融合蛋白转变，表达的重组抗原不含或极少含非特异性或共同抗原成分，并可为某一目的蛋白设计表达特定的多肽抗原片段;在抗体体系中，则由多克隆、单克隆抗体向基因工程抗体和双功能抗体转变，甚至采用基因重组的人源化和小型化的单链可变区(VH和VL)片段(scFv)抗体[1]。检测系统也已经和正在实现自动化、集成化和微型化(如蛋白芯片与免疫传感器的应用)。这一发展趋势将有助于实验操作的规范化和标准化，提高实验结果的准确性和重复性，并有助于实验室之间检测结果的互认。

（实习编辑：陈战锋）